Come si forma il rene nell’embriogenesi?
Il rene dei mammiferi, il metanefro, è il terzo paio di organi escretori a formarsi durante l’embriogenesi e l’unico a persistere nell’animale postnatale. La sua formazione comporta una complessa interazione tra la gemma ureterale ramificata, che formerà i dotti collettori, e il mesenchima circostante, che dà origine a tutti i tipi di cellule epiteliali all’interno dei nefroni. Queste popolazioni cellulari si impegnano in un processo di induzione reciproca per guidare la massima organogenesi. I percorsi molecolari espressi durante la normale morfogenesi del rene nel topo, compresi i tipi cellulari che esprimono ciascun percorso e i tempi di questa espressione, sono stati ampiamente documentati e studiati dal punto di vista funzionale. Di conseguenza, le principali reti trascrizionali e i percorsi di segnalazione dei fattori di crescita sono stati identificati fattori critici per la formazione dell’epitelio ureterale ramificato e la maturazione cellulare del mesenchima primordiale.
Sebbene espressi anche nello sviluppo di molti altri organi, sono stati identificati ruoli chiave per le vie di segnalazione dei fattori di crescita WNT, FGF, BMP, Notch e Hedgehog e per le famiglie dei fattori di trascrizione HOX, PAX, FOX, SIX e SOX nella morfogenesi renale. Sebbene i nefroni modellati e segmentati finali contengano numerosi tipi cellulari funzionalmente distinti, il tracciamento del lignaggio ha dimostrato che questi tipi cellulari sono tutti formati da una singola popolazione progenitrice, il mesenchima superiore che esprime SIX2. Tuttavia, questa popolazione non è presente nel rene postnatale. Tutti i circa 1 milione di nefroni presenti nel rene postnatale umano si formano prima della nascita. La perdita della popolazione progenitrice del nefrone limita le opzioni di rigenerazione nell’organo postnatale. Nonostante ciò, il rene dei mammiferi postnatale può subire una riparazione sostanziale in risposta all’insufficienza renale acuta (IREA).
Sebbene il rene postnatale possa apparentemente ripararsi dopo una lesione acuta, sia nell’uomo che nei topi episodi ripetuti di IREA provocano progressivamente una segnalazione aberrante tra l’epitelio tubulare e i tipi cellulari non tubolari circostanti, con conseguente fibrosi interstiziale e perdita del microcircolo (rarefazione). Infatti, anche un singolo episodio grave di lesione acuta, come un ritardo nella funzionalità dell’organo dopo il trapianto, può suscitare questa risposta. Tale fibrosi è un segno distintivo della malattia renale cronica (IRC). L’evidenza che un episodio di IREA può contribuire a una futura IRC ha nuovamente focalizzato l’attenzione sul processo di riparazione stesso e sulla comprensione del motivo per cui si verifica una riparazione incompleta. Inoltre, c’è stato un particolare interesse per l’espressione prolungata delle vie di segnalazione dei fattori di crescita precedentemente attive durante lo sviluppo renale.
Il processo di riparazione tubulare nel rene danneggiato
La risposta del rene adulto è stata studiata prevalentemente in modelli di roditori con lesioni acute. Forse il modello più comunemente utilizzato è il danno da ischemia-riperfusione (DIRE). Come negli esseri umani, questo modello murino mostra un rapido declino della funzione renale accompagnato da una perdita dell’orletto a spazzola del tubo prossimale e da un’infiammazione. Nei topi, ciò è accompagnato anche dalla formazione di cilindri proteici tubolari. All’interno dei tubuli, la proliferazione cellulare è evidente entro 24-48 ore dalla lesione e la mJorfologia epiteliale viene apparentemente ripristinata dopo 5-7 giorni. Gli studi sui cambiamenti patologici osservati dopo il danno ischemico descrivono quattro fasi istologiche di questa risposta. Durante la fase iniziale di risposta allo stress, è stato segnalato che gli epiteli vanno incontro sia ad apoptosi che a necrosi.
In studi più recenti, in particolare nell’IREA associata all’infiammazione, sono state segnalate anche una serie di altre forme di morte cellulare specializzata, tra cui anoikis, necroptosi (per lo più da farmaci), morte autofagica e piroptosi (morte infiammatoria). Molti di questi sono più strettamente legati alla componente infiammatoria del danno renale, che spesso è meno marcata nei modelli sperimentali, come il danno tossico o un DIRE. Una piccola differenza è a carico della tipologia di morte cellulare anoikis (letteralmente “senza dimora”), che avviene quando il substrato cellulare si distacca dalla matrice originale perché perde le molecole di adesione o un trauma fisico equivalente permette ciò. La seconda fase della risposta al danno è caratterizzata da appiattimento e dedifferenziazione (ritorno allo stato embrionale) tubulare con perdita della morfologia epiteliale.
Questo è seguito da un periodo di pronunciata proliferazione ed espressione di fattori di crescita, tra cui IGF1, HGF e FGF2. Durante la quarta fase di risoluzione viene ripristinato un aspetto istologico apparentemente normale dell’epitelio. Mentre nella maggior parte dei modelli animali la morfologia tubulare è sostanzialmente normalizzata e l’evidenza delle risposte infiammatorie si risolve entro una settimana, nessuno studio ha distinto in modo definitivo tra cellule epiteliali iniziali ancora presenti nei tubuli e nuovo epitelio derivante attraverso un meccanismo di riparazione. Nel contesto di una IREA grave, quando si verifica un evento iniziale di normalizzazione, è stato segnalato che una seconda risposta molecolarmente distinta si verifica intorno ai giorni 10-14 dopo la lesione, che può contribuire all’infiammazione cronica e alla fibrosi. Questo è poco compreso e, ancora, non ben caratterizzato.
L’epitelio tubulare postnatale era tradizionalmente considerato non proliferativo a meno che non fosse sottoposto a lesioni. Infatti, vi è evidenza di un lento ricambio dell’epitelio tubulare postnatale anche in assenza di lesioni. Tuttavia, è accettato che la capacità dell’epitelio danneggiato di ritornare alla normalità dipende dall’ampia proliferazione di cellule all’interno dei tubuli. Il segmento S3 del tubulo prossimale è stato notato per la prima volta come il sito della risposta più proliferativa, con cellule proliferanti antigene nucleare positive che esprimono anche vimentina 8Proteina dello scheletro cellulare), suggerendo il passaggio da uno stato epiteliale a uno mesenchimale in risposta alla lesione. È stato suggerito il concetto che tali cellule dedifferenziate potrebbero rappresentare una popolazione progenitrice.
Studi successivi hanno concluso che qualsiasi cellula tubulare differenziata potrebbe proliferare in risposta al danno e che fino al 40% delle cellule all’interno del tubulo prossimale S3 riposano in fase G1 anziché in G0 e sono quindi pronte a rientrare nel ciclo cellulare. Si è ipotizzato, quindi, che qualsiasi cellula epiteliale potesse rientrare nel ciclo cellulare quando necessario, facilitando il ripopolamento dei tubuli da cui alcune cellule erano state perse. Il concetto che potrebbe esserci anche un contributo di cellule all’epitelio da popolazioni di cellule non epiteliali è stato ignorato dopo che studi di tracciamento del lignaggio hanno suggerito che solo le cellule epiteliali tubulari (derivate dal mesenchima Six2+) contribuivano al processo di riparazione. Questo è stato visto come un processo di dedifferenziazione seguito da ridifferenziazione disponibile per qualsiasi cellula epiteliale matura sopravvissuta.
Tuttavia, i meccanismi molecolari che governano i cambiamenti morfologici che portano alla riparazione sono stati più difficili da analizzare. Le prime analisi dei cambiamenti trascrizionali in risposta alla lesione hanno rilevato l’espressione di geni segnalati anche durante lo sviluppo. Sulla base dell’espressione dei marcatori mesenchimali, della Vimentina e dei marcatori tubulari precoci (come Pax2) all’interno di tali cellule epiteliali dedifferenziate, la riparazione è stata vista come il ritorno delle cellule epiteliali tubulari mature a uno stato di sviluppo più primitivo.
Vie genetiche dello sviluppo nella riparazione renale
Esiste una lunga storia di studi sui cambiamenti nell’espressione genica durante la risposta al danno/riparazione nel rene. In effetti, l’identificazione dei biomarkers chiave della risposta al danno iniziale, KIM1 e NGAL, si è basata su studi sui cambiamenti genetici differenziali nelle prime fasi del periodo di risposta al danno, considerati semplicemente come una perdita della morfologia epiteliale durante la lesione. Tuttavia, è stata segnalata l’espressione di numerosi geni nefrogenici in associazione con la risposta proliferativa iniziale al danno. Questi includono PAX2, FGF2, BMP7 e LHX1. Negli studi che hanno valutato l’efficacia dei composti nel danno renale, è stato riportato che la sovraregolazione di HGF, WT1, PAX2 e BMP7 si associa a un miglioramento della funzionalità renale e a un aumento delle cellule progenitrici renali positive per i recettori CD133/CD24.
Infatti, l’uso del fattore morfogenico BMP7 per opporsi all’attività fibrotica del TGFβ1 è stato ampiamente studiato come terapia. Sono stati segnalati numerosi fattori di trascrizione in associazione al danno renale. Di notevole interesse è stato il fattore di trascrizione Pax2. Inizialmente espresso durante lo sviluppo renale sia nell’epitelio ureterale che nei nefroni in formazione, l’espressione postnatale di Pax2 è confinata al dotto collettore, tranne in risposta a lesioni tubulari acute, dove è stata segnalata nell’epitelio proliferante. Infatti, la presenza dell’espressione di Pax2 è stata associata alla positività per CD24 nell’epitelio renale di ratto dopo la lesione, interpretata come un ritorno allo stato progenitore. Tuttavia, non sono stati condotti studi che esplorino il ruolo di Pax2 o la necessità di Pax2 nella risposta riparativa, e quindi il significato di questa espressione rimane poco chiaro.
È stata segnalata anche la sovraregolazione di molti percorsi dei fattori di crescita dello sviluppo in risposta al danno renale. Questi includono i geni del percorso HGF, IGF, VEGF, BMP, Wnt e Notch. Durante lo sviluppo, l’espressione di VEGF-A dai podociti avvia la formazione dei capillari glomerulari attirando progenitori endoteliali dallo stroma circostante. È stato ora dimostrato che la continua produzione di VEGF da parte dei podociti durante la vita postnatale è fondamentale per la normale funzione renale. Anche la riespressione sia di VegfA che del recettore dell’angpoietina (Tie2) è stata associata alla fase proliferativa precoce della risposta IREA. Villanueva et al. hanno studiato il ruolo di FGF2 (FGF basico) in un modello di danno ischemico nel ratto, concludendo che la sua somministrazione durante l’insulto ipossico accelera questo modello di espressione genica dello sviluppo e ha ridotto l’evidenza di un ritorno embrionale all’interno della popolazione epiteliale.
Recente analisi trascrizionale della riparazione renale
Sebbene siano stati identificati molti dei geni dello sviluppo precedentemente visti come sovraregolati nelle lesioni, inclusi Notch1/2, Jag1 e Ret, altri erano sottoregolati (tra cui Lhx1, Fgf20, Gli2 e Ptch1 nelle cellule epiteliali e Ptch1 e Smo nei fibroblasti vascolari) o apparentemente inalterato (nessun cambiamento in Pax2 in nessun tipo di cellula). È importante sottolineare che un certo numero di geni sovraregolati lo hanno fatto in tipi cellulari inaspettati. Ad esempio, la sovraregolazione di Wnt4, Wnt9b, Wnt11, Bmp7 e Vegfa era limitata alla popolazione di cellule endoteliali, un tipo di cellula non noto per esprimere questi geni durante lo sviluppo. Ciò suggerirebbe che i ruoli di tali geni nella risposta al danno siano distinti dal loro ruolo nello sviluppo. È stato uno studio del 2017 a identificare c-Myc e N-Myc, regolatori della proliferazione cellulare, e SOX9, come i geni più altamente sovraregolati all’interno dell’epitelio tubulare del rene danneggiato.
Kumar et al. hanno studiato ulteriormente questo aspetto, dimostrando che la sovraregolazione di Sox9 ha preceduto l’espressione di biomarkers accettati di danno renale, Lcn2 (Ngal) e Kim1, suggerendo un ruolo molto precoce nella fase di risposta. Sebbene i livelli di espressione di Sox9 abbiano raggiunto il picco a 24-48 ore, così come i livelli di creatinina sierica, l’aumento dell’espressione è persistito per 28 giorni nonostante il ritorno alla normalità delle letture della funzionalità renale. Un’induzione simile di Sox9 è stata osservata in risposta a un secondo modello di infortunio; ostruzione ureterale unilaterale.Capire quali fattori di trascrizione o loro mediatori si attivano nelle fasi del danno/riparo renali implica interventi in molte patologie odierne le cui complicanze sono ancora poco gestibili, come il diabete, l’ipertensione, la setticemia, la IREA post-infarto e danni da uso eccessivo di antibiotici e antidolorifici FANS.
La proteina SOX9 svolge un ruolo importante nello sviluppo degli organi ma non è attiva nei reni adulti sani. Le cellule danneggiate attivano il fattore di trascrizione SOX9 per rigenerarsi. Una volta guarite, le cellule silenziano questa proteina. I ricercatori del Cedars-Sinai guidati dal professor Kumar hanno scoperto perché alcuni reni lesionati guariscono mentre altri sviluppano cicatrici che possono portare a insufficienza renale. I loro risultati, dettagliati in un articolo pubblicato sulla rivista Science, potrebbero portare allo sviluppo di test non invasivi per rilevare le cicatrici renali e, infine, a nuove terapie per invertire la condizione. Nelle loro indagini del 2017-2018, Kumar e il suo team hanno scoperto che quando i reni sono danneggiati, le cellule sopravvissute riattivano SOX9 come parte del processo di guarigione che, tuttavia, si manifesta come cicatrizzazione dei tessuti (fibrosi).
Le cellule indotte ad esprimere SOX9 apparivano come rare cellule individuali più frequentemente all’interno dei tubuli prossimali, ma anche nel tubulo distale. Le cellule Sox9+ rappresentavano un sottoinsieme dell’epitelio KIM1+ e il 40% mostrava evidenza di proliferazione. A 28 giorni dalla lesione, quei tubuli contenevano cellule Sox9+KIM1+. Ciò suggerirebbe la persistenza di un profilo di espressione genica alterato molto tempo dopo un apparente ritorno ad un’istologia tubulare normale. Il tracciamento del lignaggio ha mostrato che le cellule indotte dalla lesione ad esprimere Sox9 hanno dato un contributo importante all’ansa distale prossimale e all’ansa dell’epitelio di Henle. Sox9 è certamente espresso durante lo sviluppo renale, sia nell’epitelio ureterale che nei nefroni allungati e segmentati. Precedenti studi che hanno indagato il ruolo di questo gene nello sviluppo si sono concentrati sul dotto collettore.
Nessun difetto è stato osservato nei topi mutanti Sox9, a meno che non sia accompagnato da una delezione del paralogo, Sox8, che è espresso anche nell’epitelio renale in via di sviluppo. L’espressione di Sox9, tuttavia, si estende ai nefroni in formazione. Kang et al. hanno riferito che durante lo sviluppo in vivo, la maggior parte delle cellule Sox9+ prolifera (85%), suggerendo una popolazione progenitrice. In questo ultimo studio pubblicato, Kumar e colleghi ricercatori hanno studiato il danno renale nei topi di laboratorio. Hanno etichettato le singole cellule nel punto della lesione, quindi hanno seguito l’evoluzione della progenie delle cellule nel tempo. Al decimo giorno dal danno, i discendenti di alcune cellule erano completamente guariti mentre altri no. La linea cellulare guarita aveva disattivato l’espressione di SOX9, mentre la linea cellulare non guarita, nel tentativo continuo di rigenerarsi completamente, manteneva l’attività di SOX9.
Inoltre, i ricercatori hanno scoperto che le cellule che non erano in grado di rigenerarsi iniziarono a reclutare proteine chiamate Wnts, altri attor ichiave nello sviluppo degli organi. Nel corso del tempo, questo accumulo di Wnts ha innescato cicatrici e la disattivazione di SOX9 una settimana dopo il danno renale promuoveva il recupero dei reni. I ricercatori hanno osservato lo stesso processo nei database dei pazienti di istituzioni collaboratrici in Svizzera e Belgio. Possono disporre anche dell’informazione ottenuta da un altro tema di ricerca che ha scoperto come la proteina zinc finger 24 (ZFP24) governa la sovraregolazione di SOX9 nelle cellule epiteliali tubulari. ZFP24, un fattore di trascrizione, è essenziale per la maturazione degli oligodendrociti e la sintesi di mielina nel cervello. Tuttavia, il suo ruolo nei reni o nella regolazione di SOX9 era sconosciuto. La sua ablazione dall’epitelio tubulare ha esacerbato l’IREA associata al cisplatino, all’ischemia e al danno da proteine muscolari (rabdomiolisi).
È importante sottolineare che la delezione del gene ZFP24 ha comportato la soppressione della sovraregolazione di SOX9 nelle cellule epiteliali tubulari danneggiate. Tutte queste scoperte ed informazioeni forniscono obiettivi per lo sviluppo di farmaci, nonché per la scoperta di biomarkers non invasivi che consentano la diagnosi di fibrosi renale attraverso le urine. Attualmente, infatti, l’unico test disponibile per la fibrosi renale è la biopsia, che comporta molti rischi e svantaggi sul paziente.
- A cura del Dr. Gianfrancesco Cormaci, PhD, specialista in Biochimica Clinica.
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