Malattia di Huntington: introduzione ed eziologia
La malattia di Huntington (HD) è una malattia neurodegenerativa autosomica dominante. I suoi tratti caratteristici includono deterioramento mentale, disturbi psichiatrici e disfunzione motoria, principalmente la corea, un disturbo del movimento involontario. Si ritiene che questi sintomi derivino dall’aggregazione cellulare e dall’attività della proteina huntingtina mutata (Htt) nel citoplasma e nei nuclei dei neuroni. Htt è principalmente una proteina citoplasmatica essenziale per l’embriogenesi e lo sviluppo. Mentre Htt è espresso attraverso il sistema nervoso centrale, i neuroni spinosi medi (MSN) nei gangli della base dello striato mostrano una specifica suscettibilità alla neurodegenerazione nella MH. Al momento, non sono disponibili trattamenti modificanti la malattia per questa condizione, con l’unico farmaco attualmente approvato dalla FDA per l’HD che è la tetrabenazina, un inibitore reversibile del trasportatore vescicolare delle monoamine di tipo 2 (VMAT2).
Si ritiene che la Htt sia collegata a una serie di processi, tra cui il traffico di proteine e il trasporto delle vescicole. In quanto tale, un possibile ruolo come proteina dell’impalcatura è plausibile. Htt è codificata dal gene IT15, in cui l’espansione instabile di una sequenza di tre basi (CAG, che codifica per la glutammina) nell’esone 1 porta alla produzione di una proteina con un tratto allungato di residui di glutammina (un tratto di poliglutammina (polyQ)) al suo terminale amminico. Se si riscontrano più di 35 recidive CAG, la proteina espressa (huntingtina mutante, mHtt) ha caratteristiche che variano dal prodotto proteico standard. Entrambi gli alleli mutanti e wild-type (wt) sono espressi nella HD. Se ci sono più di 40 elementi ripetuti CAG in un allele, allora è geneticamente penetrante. I domini contenenti più residui di glutammina sono spesso legati alla mediazione delle interazioni proteina-proteina e richiedono un particolare livello di flessibilità conformazionale intrinseca.
Si ritiene che le mutazioni che hanno un impatto su quest’area influenzino questa flessibilità e, di conseguenza, l’attività proteica. L’Htt mutante e frammenti di esso stimolano processi sia deleteri che compensativi che lasciano i neuroni colpiti più vulnerabili a lesioni generali, come fattori di stress ossidativi ed eccitotossici. Diversi modelli transgenici in vivo e in vitro sono stati prodotti per studiare la patologia ei fenotipi comportamentali della HD, con particolare attenzione a deficit motori, inclusioni intranucleari, disregolazione trascrizionale e mitocondriale ed eccitotossicità. L’utilizzo di questi modelli come base per la ricerca sui processi alla base dei sintomi motori e non motori della HD ha avuto successo; tuttavia, i farmaci attualmente disponibili per la HD non sono stati in grado di controbilanciare l’avanzamento del disturbo. Tuttavia, il trattamento sintomatico può alleviare i sintomi della malattia, mentre le terapie rigenerative potrebbero soppiantare i neuroni compromessi.
Patogenesi: proteolisi e corpi di inclusione
I corpi di inclusione sono un simbolo patologico della MH e si osservano tipicamente nelle cellule in cui è espresso mHtt. Sono costituiti da aggregati proteici contenenti frammenti mHtt N-terminali tossici, che sono prodotti dagli enzimi caspasi, calpaina e metalloproteinasi della matrice (MMP) espressi nei MSN. Gli aggregati includono anche varie proteine sequestrate, tra cui l’ubiquitina e le proteine chaperone. Gli aggregati nucleari sono costituiti principalmente dai letali frammenti mHtt, mentre le inclusioni citoplasmatiche contengono sia mHtt a lunghezza intera che troncato. Non è del tutto noto se i corpi di inclusione coincidano semplicemente con la malattia o se essi stessi siano citotossici. Diverse linee di evidenza indicano che isolando frammenti mHtt diffusi, le inclusioni estendono la sopravvivenza cellulare. Ad esempio, è dimostrato che la piccola molecola B2 incoraggia la formazione di inclusioni, inibendo anche la disfunzione del proteasoma mediata da mHtt in un modello cellulare HD.
L’illuminazione sulla progressione della malattia può, quindi, essere ottenuta attraverso una maggiore comprensione dei meccanismi alla base dell’elaborazione mHtt e della formazione del corpo di inclusione. È stato anche suggerito che la presenza di aggregati cellulari alimenti l’autofagia. Al contrario, la prevenzione dell’autofagia aumenta la formazione di aggregati e i livelli di mHtt solubile. Una gamma di composti che inducono l’autofagia ha dimostrato l’efficacia nei modelli HD: la rapamicina sopprime mTOR, un regolatore negativo dell’autofagia che è anche sequestrato in aggregati. È stato dimostrato che la rapamicina riduce l’accumulo di Htt nei modelli cellulari e difende anche dalla neurodegenerazione in un modello di moscerino della HD. SMER 28 potenzia la sintesi dell’autofagosoma e migliora la clearance di mHtt nelle cellule di mammifero. Inoltre, il verapamil, bloccante dei canali del Ca2+ e attivatore dell’autofagia, dimostra proprietà neuroprotettive in una gamma di modelli di HD.
La deacetilasi sirtuina 1 (SIRT1) inibisce la degradazione autofagica di Htt eliminando i suoi tag acetilici. Pertanto, gli inibitori selettivi di SIRT1, come EX 527, possono supportare la degradazione di Htt attraverso l’autofagia e aumentarne l’eliminazione. Tuttavia, la deacetilazione dei fattori di trascrizione regolatori da parte di SIRT1 incoraggia anche l’espressione di geni neuroprotettivi e del fattore neurotrofico derivato dal cervello (BDNF). Come risultato del suo tratto di poliglutammina anormalmente lungo, mHtt è soggetto a ripiegamento errato. Poiché le proteine chaperone possono ripiegare le proteine mal ripiegate e possono sopprimere la produzione di oligomeri di poliglutammina che in seguito formano aggregati, sono di fondamentale interesse nella ricerca sulla MH. Le proteine chaperon sono anche conosciute come proteine da shock termico (HSP), e le tre di queste che hanno un significato particolare nella HD sono Hsp90, Hsp70 e Hsp40.
È stato dimostrato che Hsp70 e Hsp40 diminuiscono la formazione di fibrille da parte delle proteine poli-Q, mentre Hsp90 elenca Htt e mHtt tra le sue proteine clienti. La soppressione di Hsp90 destabilizza l’huntingtina, favorendo la sua eliminazione da parte del sistema ubiquitina-proteasoma (UPS). Inoltre, la soppressione di Hsp90, da parte di composti come la geldanamicina, provoca l’espressione di Hsp70 e Hsp40, limitando l’aggregazione mHtt innescando una risposta di shock termico. Il composto naturale Celastrolo (triterpenoide) innesca anche una risposta di shock termico ed è stato riconosciuto in vari schermi per l’aggregazione Htt. Ulteriori inibitori Hsp90, come PU H71 e BIIB 021 possono anche essere strumenti preziosi di indagine o punti di partenza per molecole più specifiche.
Sregolazione della trascrizione genica
La mHtt ei suoi frammenti possono legarsi direttamente ai fattori di trascrizione, modificando l’espressione genica. Aggregati intranucleari contenenti mHtt sequestrano la CBP (CREB-binding protein), la proteina che lega il fattore di trascrizione CREB. mHtt si lega al dominio dell’acetiltransferasi della CBP, così come al co-attivatore p300. La successiva diminuzione dell’attività dell’acetiltransferasi può essere contrastata mediante l’uso di inibitori dell’istone deacetilasi (HDAC): il butirrato di sodio aumenta le possibilità di sopravvivenza dei neuroni HD in coltura, mentre il SAHA penetra nel cervello e diminuisce i deficit motori nei modelli murini della malattia. La disregolazione trascrizionale ha un impatto sui livelli di BDNF e del suo recettore, TrkB, entrambi frequentemente sottoregolati nella HD.
L’abbassamento della produzione di BDNF provoca un aumento della perdita neuronale, quindi riportarla ai livelli normali potrebbe aiutare la sopravvivenza dei neuroni striatali. Aumentare i livelli di BDNF attraverso percorsi a monte ea valle può essere un’opzione terapeuticamente fattibile. L’infusione di BDNF ricombinante, l’uso di innesti cellulari che rilasciano BDNF e i mimetici del BDNF sono tutti possibili approcci attualmente in fase di ricerca fondamentale. I recettori TrkB possono essere transattivati dai recettori A2A dell’adenosina; la soppressione di questi ultimi da parte di composti come lo SCH 58261, è neuroprotettiva nei modelli eccitotossici di HD, il che è indicativo di un ruolo di TrkB nell’eccitotossicità neuronale.
La disfunzione mitocondriale
I neuroni in genere hanno bisogno di alti livelli di ATP per sostenere funzioni come la polarizzazione della membrana e il traffico delle vescicole. In particolare, i MSN necessitano di grandi quantità di energia dalla fosforilazione ossidativa e sono quindi particolarmente sensibili alla disfunzione mitocondriale che si manifesta spesso nei modelli HD. mHtt si associa alla membrana esterna dei mitocondri, causando danni ai complessi della catena di trasporto degli elettroni II e III. La ridotta funzione mitocondriale ha anche legami provati con una maggiore attività dell’enzima transglutaminasi 2 (TG2). La TG2 si accumula nelle cellule sotto stress ed è sovraregolata nei modelli animali di HD. La sua cancellazione in due modelli murini HD ha portato a migliori tassi di sopravvivenza e ha ridotto la morte neuronale. La soppressione farmacologica di TG2 inverte la vulnerabilità delle cellule HD umane a 3-NP e allevia anche la disregolazione trascrizionale.
La cistamina è un inibitore della transglutaminasi che aumenta anche la secrezione di BDNF (e quindi i suoi livelli endogeni). È stato dimostrato che aumenta le prestazioni motorie e prolunga la sopravvivenza nei topi con MH. I mitocondri condividono stretti legami con la generazione di specie reattive dell’ossigeno (ROS). Livelli eccessivi di ROS portano allo stress ossidativo, che è accentuato nelle cellule HD. In quanto tali, gli antiossidanti sono stati studiati negli studi sulla MH. Nrf2, un fattore di trascrizione legato alla risposta antiossidante e che è innescato dallo stress, è anche neuroprotettivo in un modello HD. Nrf2 riduce la durata media dei polipeptidi contenenti un’espansione polyQ e, inoltre, aumenta la sopravvivenza neuronale in vitro. Di conseguenza, Nrf2 contribuisce in modo cruciale alla clearance della proteina malata. I suoi attivatori noti come TAT 14, DMF e MMF possono essere strumenti utili di indagine ed intervento.
Il ruolo della eccitotossicità: glutammato e chinurenina
Come delineato sopra, la HD ha un impatto prevalentemente sui MSN striatali, una popolazione di neuroni che riceve sia segnali di glutammato dalla corteccia che segnali di dopamina dalla substantia nigra. Un’ipotesi consolidata suggerisce che alti livelli di neurotrasmettitori eccitatori e/o l’attivazione dei recettori postsinaptici del glutammato (in particolare il recettore NMDA) sulle membrane MSN li sensibilizzi alla morte cellulare eccitotossica. Il raggruppamento di varie afferenze glutamatergiche e la composizione distintiva del sottotipo di recettore NMDA (NR1A e NR2B) nei MSN potrebbe renderli suscettibili di danno nella MH. Poiché i MSN sono GABAergici, si ritiene che la perdita del loro input inibitorio al globo pallido sia alla base dei movimenti coreici tipici della HD.
Si ritiene che la mHtt aumenti l’attività dei recettori NMDA e NR1A e NR2B sono particolarmente vulnerabili a un aumento del flusso di corrente mediato da mHtt. Gli agonisti e gli antagonisti dei recettori NMDA sono stati ampiamente impiegati nella ricerca fondamentale sulla HD. L’acido chinolinico, un agonista endogeno del recettore NMDA, è spesso impiegato per produrre modelli HD, mentre è stato dimostrato che l’antagonista del recettore NMDA (+)-MK-801 inibisce la perdita di cellule neuronali causata dalle tossine mitocondriali. Dimebon mostra affinità per i recettori NMDA e mostra effetti neuroprotettivi nei modelli cellulari HD, ma il suo sviluppo clinico per la terapia HD è cessato.
È stato riscontrato che il tasso di assorbimento del glutammato ha una relazione inversa con il numero di ripetizioni CAG; il tasso di assorbimento del glutammato, e quindi la clearance dalla fessura sinaptica, è basso nei tessuti cerebrali MH. L’espressione e la funzione del trasportatore di glutammato di roditori GLT-1 (ortologo di EAAT2) sono diminuite da mHtt. Pertanto, può essere utile aumentare l’assorbimento del glutammato o prevenirne il rilascio. L’anticonvulsivante lamotrigina impedisce il rilascio di glutammato e può rallentare l’avanzamento della malattia. Tuttavia, l’inibitore del rilascio di glutammato riluzolo non è riuscito a dimostrare alcun effetto vantaggioso in uno studio HD di fase III.
Possibili interventi mirati: la dopamina
Si ritiene che la dopamina agisca in sinergia con il glutammato per aumentare i livelli di Ca2+, sensibilizzando i neuroni striatali alla tossicità mHtt e inducendo l’apoptosi nei MSN. Alte dosi di dopamina possono anche provocare la morte cellulare dei neuroni striatali, molto probabilmente attraverso lo stress ossidativo. La somministrazione continua del precursore della dopamina L-DOPA provoca un aumento dei livelli di dopamina e aumenta la perdita di MSN nei topi con MH, oltre ad aggravare i sintomi discinetici nei pazienti con MH. D’altra parte, L-DOPA ha un esito favorevole per i pazienti con PD, ripristinando la funzione motoria aumentando le concentrazioni di dopamina che sono influenzate dalla degenerazione della substantia nigra. La disfunzione motoria e la perdita di MSN sono evidenti anche nei topi knockout del trasportatore della dopamina, che hanno livelli di dopamina elevati in modo affidabile.
È stato scoperto che gli “stabilizzatori” della dopamina, come la pridopidina e l’OSU-6162, riducono l’attività locomotoria nei modelli animali quando i livelli di dopamina sono elevati. Entrambi si legano e si staccano rapidamente dai recettori D2 della dopamina, che, insieme ai recettori D1, sono ampiamente espressi nei MSN. La ricerca contemporanea ha indicato che gli impatti di questi composti possono anche essere mediati dai recettori σ1 sigma-1), per i quali dimostrano affinità nanomolare in vitro. Si pensa che la tetrabenazina, l’inibitore reversibile di VMAT2, aumenti la funzione motoria drenando le vescicole di immagazzinamento della dopamina. Tuttavia, mostra alcuni gravi effetti collaterali come la depressione a causa dell’abbassamento dei livelli di serotonina. Anche un ulteriore inibitore VMAT2, la reserpina, riduce le riserve di dopamina, ma mostra un legame irreversibile ed è più letale.
Infine, l’enzima chinurenina 3-monoossigenasi (KMO) è legato al metabolismo del triptofano. I metaboliti nella via della chinurenina, prodotti attraverso la degradazione del triptofano, sono associati alla HD. L’eccitotossicità e la produzione di radicali liberi sono legate a bassi livelli di acido chinurenico. L’inibitore KMO chiamato Ro 61-8048 aumenta i livelli di acido chinurenico, diminuendo i livelli di glutammato extracellulare e inibendo la perdita sinaptica in un modello murino di HD. Maggiori concentrazioni di acido chinurenico interagiscono anche col sito della glicina dei recettori NMDA. Inoltre mentre alcuni metaboliti del triptofano sono eccitotossici (chinurenina, antranilato, acido chinolinico), l’acido chinurenico è antagonista. Quindi l’uso di modulatori della via del triptofano è da considerare attentamente per gestire la HD.
Le maggiori sfide cliniche
1: mancanza di importanti percorsi cellulari e molecolari per bersagli farmaceutici
Sebbene siano stati documentati diversi percorsi molecolari e cellulari associati alla MH, è mancata l’identificazione di percorsi chiave che svolgono un ruolo significativo nella patologia della malattia. Alcuni studi hanno riportato che l’aggregazione di polyQ e l’huntingtin mutante piegato erroneamente (mHtt) causano neurotossicità. Questi studi hanno anche riportato il ruolo di mHtt nella dinamica mitocondriale; per esempio, mHtt aumenta l’immobilità mitocondriale nei neuroni e causa la disregolazione della bioenergetica mitocondriale. L’analisi genomica ha rivelato il legame tra l’incidenza di HD e i cambiamenti nell’espressione di molti geni (ad esempio, mHtt regola la trascrizione).
Pertanto, è importante determinare uno specifico percorso molecolare che svolge un ruolo importante nella patologia HD. Inoltre, è imperativo capire quali processi devono essere bloccati per prevenire il verificarsi di HD. Gli scienziati hanno anche sottolineato l’importanza di comprendere il ruolo della proteina huntingtina wild-type nella prognosi della malattia. Diversi studi hanno dimostrato che l’Htt wild-type è una grande proteina multidominio che interagisce direttamente o indirettamente con più proteine. La mancanza di informazioni appropriate su uno specifico percorso molecolare che induca sufficientemente la patologia associata alla MH presenta sostanziali difficoltà nella formulazione di strategie per prevenire la MH o bloccare la progressione della malattia.
2: mancanza di modelli animali adeguati per valutare gli approcci terapeutici
Lo sviluppo di un modello transgenico appropriato per la HD è difficile a causa delle dimensioni del gene mutato. Inoltre, le variazioni nel numero di ripetizioni polyQ tra i pazienti e l’espressione della patologia correlata a mHtt solo in aree selezionate del cervello pongono problemi nello sviluppo di un modello animale adeguato per studiare l’HD. I ricercatori affermano che è difficile ricapitolare e determinare la lenta progressione della malattia, delle patologie cognitive e delle dipendenze dall’età nei modelli animali. Sebbene siano stati sviluppati molti modelli per studiare l’HD con frammenti N-terminali e mHtt a lunghezza intera, variano sostanzialmente, poiché ciascuno imita un particolare sintomo e tasso di progressione della malattia. Questo perché l’espressione di frammenti di mHtt o della forma intera induce solo alcune delle patologie HD, che determinano il tipo di modello animale. Gli scienziati hanno progettato con successo modelli animali con anomalie del sonno, anomalie cognitive e comportamentali e una durata di vita limitata associata alla HD. Ogni modello contiene un diverso grado di neurodegenerazione regionale o generale. Poiché ogni modello ha alcune limitazioni, è difficile selezionare il modello più adatto per un particolare studio sulla HD.
3: Difficoltà associate allo sviluppo di sperimentazioni cliniche
Le sfide associate allo sviluppo di sperimentazioni cliniche per la MH sono simili a quelle legate agli studi clinici di altre malattie rare. Alcune difficoltà legate agli studi clinici sulla MH includono campioni di piccole dimensioni, sfide geografiche per i pazienti per accedere ai siti di sperimentazione, ecc. Inoltre, poiché la progressione della malattia MH è prolungata con gravità e tasso di progressione differenziali, la valutazione clinica della malattia non è adeguatamente oggettivo, quantitativo e robusto. A causa della mancanza di marcatori surrogati, i ricercatori non riescono a determinare la progressione della malattia e l’efficacia terapeutica in un breve periodo di prova
- A cura del Dr. Gianfrancesco Cormaci, PhD, specialista in Biochimica Clinica.
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