Strategie di riparo del DNA
La capacità di riconoscere e rispondere al danno del DNA è una proprietà universale degli organismi viventi. La capacità di riparare il DNA si trova dagli organismi più minuscoli come (batteri e micoplasmi) fino ai vertebrati e le piante. Il danno al DNA era una volta competenza dei radiobiologi, che giravano intorno ad un mistero fondamentale di come piccole quantità di energia potessero causare un così grande danno cellulare, quando erogata sotto forma di ionizzazioni piuttosto che come energia termica. Ora, la capacità cellulare di rispondere ai danni da radiazioni, radicali liberi e sostanze chimiche reattive è vista come una caratteristica centrale dell’omeostasi degli organismi viventi. Al centro di tutte le risposte cellulari al danno del DNA, sia che provenga da radiazioni ionizzanti esterne o dalla luce UV, sia da fonti interne come il metabolismo ossidativo, è la questione del meccanismo con cui viene riconosciuto il DNA danneggiato. I sistemi di riparazione del DNA ora noti includono un’ampia varietà di soluzioni al problema del riconoscimento dei danni. Due importanti soluzioni si sono evolute in base alla natura del danno: a) la riparazione di escissione di base con un meccanismo di riconoscimento stretto e altamente specifico e b) la riparazione dell’escissione di nucleotidi (NER) con una capacità di riconoscimento molto più ampia e versatile. Questi due meccanismi si distinguono inoltre per la separazione del riconoscimento del danno dall’attività catalitica. Nella riparazione di escissione di base, la proteina che riconosce e si lega alla base danneggiata è enzimaticamente attiva ed ha quindi funzione enzimatica. Nel caso della NER, l’evento di riconoscimento coinvolge una proteina che non è enzimaticamente attiva, ma che funge da sito di legame o ancoraggio su cui poi si aggregano le proteine enzimatiche.
La separazione del riconoscimento dalla catalisi si è verificata anche nella riparazione di errori di allineamento (mismatch). Questo percorso agisce principalmente su basi singolarmente non corrispondenti che si verificano durante gli errori di replicazione del DNA. Esso deriva come risultato della deaminazione della 5-metilcitosina per formare uracile. Una coppia di basi o anello non corrispondenti funge da sito di legame per una proteina che recluta un lungo tratto di DNA contenente una tacca in DNA appena replicato, da cui il filamento nascente viene degradato e risintetizzato. La somiglianza in linea di principio si riflette nella sovrapposizione osservata tra NER e riparazione di mismatch, in alcune delle loro specificità di substrato e nella capacità della NER di accoppiarsi all’espressione genica trascrizionale. Queste sovrapposizioni portano a risultati imprevisti: ad esempio, le cellule difettose nella riparazione di mismatch possono esibire una maggiore resistenza agli agenti che danneggiano il DNA e non mostrano l’aumento dei tassi di riparazione dei danni UV solitamente osservati in cellule normali. La riparazione di base opera principalmente su semplici modifiche su base singola, molte delle quali possono derivare da un danno interno come quello ossidativo. La riparazione coinvolge sistemi di apparente elevata specificità con cui le basi danneggiate vengono rimosse dalla scissione del legame zucchero-base. L’uracile-N-glicosilasi, l’endonucleasi III e gli enzimi correlati della NER sembrano agire in questo modo, per rimuovere dal DNA l’uracile e altre basi anomale.
Scoperta del gene XPA
XPA è stato riconosciuto come uno degli otto geni alla base del disturbo umano Xeroderma Pigmentoso (XP) ed è stato associato ad alcuni dei pazienti più gravemente colpiti. È ormai noto che tutti i geni svolgono un ruolo nella risposta delle cellule umane ai danni dei raggi UV; sette dei geni (XPA-XPG) rappresentano componenti del sistema NER e l’ottavo, che è attualmente non clonato, è probabilmente un cofattore coinvolto nella progressione della forcella di replicazione sul DNA parentale danneggiato. Le mutazioni nel gene XPA comportano la perdita della capacità di riparare i danni UV da fonti solari o artificiali, nelle gamme UVC e UVB (approssimativamente fino a 280 o 300 nm), il che rende le cellule XP-A coltivate estremamente sensibili ai raggi UV. I pazienti mostrano un aumento da 1000 a 10000 volte dell’incidenza specifica per età del cancro della pelle sulle aree esposte al sole. L’evidenza che il prodotto genico è responsabile per il riconoscimento iniziale del danno al DNA, proviene da una serie di esperimenti che sono diventati possibili una volta che il gene è stato clonato. XPA ha una sequenza che indica che si tratta di una proteina legante il DNA con una struttura chiamata dito di zinco (zinc finger) Cys2-Cys2. Il legame del DNA danneggiato dai raggi UV con XPA purificato è stato dimostrato essere principalmente il risultato del legame con i fotoprodotti pirimidina-pirimidone, e non con i più importanti dimeri di timina-timina. Il legame tra XPA e quest’ultima lesione è significativamente aumentato dalla formazione di un etero-dimero tra XPA e RPA. Quindi la forma funzionale di XPA nella cellula può esistere come proteina associata con RPA. Questo complesso di tre proteine (RPA14, RPA30 ed RPA70) è essenziale come punto di passaggio fra riparo del DNA e controllo della traduzione del DNA in proteine (espressione genica).
Il gene XPA: struttura
Il gene della proteina XPA è stato clonato nel 1996, si trova sul cromosoma 9 (9q34.1), contiene sei esoni e si estende approssimativamente per 23000 basi. L’espressione di XPA è straordinariamente bassa nei fibroblasti, con solo da cinque a otto molecole di mRNA di XPA presenti in ogni cellula, ponendolo tra la classe di geni con i più bassi livelli di espressione. Coerentemente con i dati di mRNA allo stato stazionario, è che il promotore intatto è straordinariamente debole nei saggi di espressione transitoria nei fibroblasti. La presenza apparente di eccesso di proteina XPA nelle cellule, è in contrasto con l’apparente limitazione del processo di riparazione globale mediato da XPA e il tasso di trascrizione estremamente basso del gene. Il suo promotore genico è straordinariamente debole. Queste osservazioni indicano che il gene XPA è all’estremo dei bassi livelli di trascrizione, ma la proteina deve essere longeva per sostenere un eccesso rispetto ai requisiti cellulari minimi. La limitazione del numero totale di siti di riparazione per nucleo deve quindi coinvolgere o qualche altro componente limitante della velocità del sistema generale, o un limite fissato dalla necessità di assemblare e disassemblare un complesso con più componenti per ogni sito da riparare. Come molti altri geni NER, il promotore dell’XPA manca dei comuni segnali di trascrizione basale (TATA, CCAAT, GC box). XPA manca anche del motivo di sequenza conservato per ERCC1 fra topo e uomo ipotizzato come elemento regolatore della NER. Una regione contenente un elemento di controllo negativo è stata identificata in entrambi i promotori XPA umani e di topo, ma la cancellazione dell’elemento negativo ha come risultato solo un aumento di due volte nell’espressione. Tuttavia, i livelli cellulari di XPA possono essere limitanti per la NER, e gli aumenti modesti hanno effetti drammatici sull’efficienza della rimozione di diverse lesioni del DNA. La variazione specifica del tessuto nei livelli degli mRNA di XPA è stata recentemente dimostrata, suggerendo che l’espressione di XPA può essere regolata dipendentemente dal tipo di cellula.
La proteina XPA: struttura e funzioni
La normale localizzazione subcellulare di XPA è nel nucleo, ma il suo sequestro specifico nel nucleo non è essenziale per la funzione. Quando l’XPA è priva del segnale di localizzazione nucleare (NLS), la proteina può ancora effettuare la riparazione del DNA nucleare. Il legame del DNA dipende dalla presenza del dito di zinco contenente quattro residui di cisteina codificati dall’esone III. La mutazione di uno qualsiasi dei quattro residui di cisteina del dito di zinco, riduce notevolmente la funzione XPA e la cancellazione dell’esone III elimina tale funzione. L’XPA lega il DNA irradiato con UV in modo leggermente migliore rispetto al DNA non irradiato. Sembra che XPA da sola riconosca solo il fotoprodotto e abbia poca affinità per i dimeri timina-timina, che sono le lesioni predominanti indotte dai raggi UV. Tuttavia, XPA forma un complesso con RPA. Il complesso XPA-RPA ha un’affinità maggiore per il DNA integro rispetto alle sole proteine e si lega preferenzialmente a dimeri timina-timina. Pertanto la specificità della lesione di XPA viene potenziata e ampliata dalla sua associazione con RPA e possibilmente con altri componenti del sistema di riparazione. Il grado di associazione può anche influenzare la specificità del sistema di riparazione, come ad esempio il requisito per la proteina XPC che lega il DNA a singolo filamento per la riparazione dei dimeri timina-timina.
Mutazioni naturali della proteina
Gli studi sulle mutazioni presenti in natura nei pazienti hanno fornito una comprensione dettagliata dei domini funzionali di XPA. Dopo la clonazione del gene XPA, sono state caratterizzate molte delle mutazioni nei pazienti XP-A. Uno dei sintomi più comuni dei pazienti con XPA è una progressiva degenerazione neurologica, con sordità, declino cognitivo ed atassia. Le manifestazioni della malattia neurologica sono spesso gravi, con esordio nella prima infanzia. Tuttavia, in alcuni casi la malattia neurologica è moderata e l’esordio è ritardato nell’adolescenza o nella prima età adulta. In generale, i pazienti XP-A presentano il difetto di riparazione del DNA più profondo con un’attività di riparazione minima o nulla e in questo gruppo i sintomi neurologici sono comuni. In XP-C i problemi della pelle sono gravi, ma i sintomi neurologici sono rari. Sintomi neurologici, dermatologici e oculari possono variare da lievi a gravi in due persone con lo stesso gruppo di complemento, o addirittura fratelli. Le manifestazioni neurologiche progressive, incluso il deterioramento cognitivo, si verificano in circa il 20-30% dei pazienti, più comunemente nei gruppi XP-A, D e G. I sintomi oculari sono osservati in quasi l’80% dei pazienti che iniziano all’inizio dell’infanzia con fotofobia e congiuntivite. In seguito, tumori maligni possono coinvolgere anche gli occhi.
I dati mutazionali indicano che i pazienti con insorgenza precoce della malattia neurologica hanno mutazioni che disattivano totalmente l’XPA. Queste mutazioni sono comunemente nella regione della proteina che lega il DNA. I pazienti con esordio ritardato della malattia neurologica presentano mutazioni che consentono l’espressione di XPA parzialmente funzionale o mutazioni puntiformi nell’esone 6. Le mutazioni di perdita includono una mutazione puntiforme che introduce un nuovo sito accettore di giunture vicino alla fine dell’introne 3 che compete con il sito normale. Le mutazioni che consentono la funzione parziale causano piccoli inserimenti o delezioni alla fine dell’esone 4 o perdita di parte o tutto dell’esone 6. Ci sono diverse mutazioni presenti in natura o vicino all’esone 6 in pazienti con insorgenza ritardata di malattia neurologica. Tre di queste mutazioni risultano in una interruzione prematura, che elimina efficacemente l’esone 6 (Arg228Term). Una forma lieve di XP è associata a una mutazione missenso proprio nell’esone 6 (His224Arg). L’istidina 224 viene sostituita da un residuo di arginina. Questa istidina potrebbe essere essenziale per una corretta interazione con TFIIH e il suo reclutamento in siti danneggiati già vincolati da XPA. Anche se istidina ed arginina sono amminoacidi basici, la loro struttura è un po’ diversa. Per tale motivo, il difetto della proteina XPA non deriverebbe da problemi di carica elettrica, ma da alterata affinità del residuo mutato per il DNA o proteine che associano ad XPA stessa.
Le lesioni neurologiche: qual’è la causa?
La radiazione UV penetra solo nella pelle. Pertanto, la causa della malattia neurologica non possono essere i fotoprodotti UV che generano lo spettro clinico dei disturbi presentati dai tumori della pelle e dai danni alla cornea. Una probabile causa dei problemi neurologici è l’accumulo di lesioni del DNA ossidato non riparate nel cervello, che provocano una morte neuronale progressiva. Alcuni ricercatori hanno ipotizzato che parte del danno deriverebbe dalla comparsa delle cosiddette ciclo-purine, prodotti di rimozione di basi danneggiate. In questo frangente, si sospetta che ci sia un’analogia fra il danno neurologico dello xeroderma e quello di altre malattie neuro-degenerative su base genetica, dove il riparo del DNA è una componente difettosa. Queste patologie comprendono la malattia di Huntington (HTT), la demenza fronto-temporale (FTD), l’atassia spino-cerebellare (SCA1) e persino il morbo di Parkinson (PD). Tuttavia, rispetto alla pelle, il sistema nervoso centrale è un sistema molto meno trattabile per gli studi biochimici e cellulari; e la comprensione dell’origine delle anomalie neurologiche nello xeroderma è ancora agli inizi. Dal momento che i pazienti oggi diagnosticati precocemente e ben protetti dalla luce solare soffrono di problemi cutanei minimi e vivono più a lungo rispetto al passato, i problemi neurologici associati allo xeroderma stanno diventando di importanza relativamente maggiore nelle famiglie XP e dovrebbero essere al centro della ricerca futura.
- A cura del Dr. Gianfrancesco Cormaci, PhD, specialista in Biochimica Clinica.
Pubblicazioni scientifiche
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